Rozgrywki toczyły się w trzech grupach: Nord (Północ), West (Zachód) oraz Süd (Południe) i występowało w nich łącznie 54 drużyny. Po zakończeniu sezonu mistrzowie każdej grupy awansowali bezpośrednio do 3. Ligi, zaś najsłabsze drużyny z każdej grupy spadały do Oberligi.
SC Victoria Hamburg (mistrz Oberligi Hamburg) zrezygnował z udziału w turnieju barażowym o awans do Regionalligi Nord z mistrzem Bremen-Ligi oraz z mistrzem Schleswig-Holstein-Ligi, dzięki czemu FC St. Pauli II zagrał w turnieju barażowym i awansował do Regionalligi (Meiendorfer SV (wicemistrz Oberligi Hamburg), ASV Bergedorf 85 (3 miejsce) oraz TSV Buchholz 08 (4 miejsce) także zrezygnowali z udziału w turnieju barażowym o awans do Regionalligi).
Goslarer SC 08, FC St. Pauli II, Tennis Borussia Berlin i Hansa Rostock II spadły do Oberligi 2010/11.
Hansa Rostock II spadła do Oberligi 2010/11 (nie otrzymała licencji na grę w Regionallidze 2010/11 i w następnym sezonie będzie występowała w Oberlidze Nordost-Nord, ponieważ 1. drużyna spadła z 2. Bundesligi do 3. Ligi, a w sezonie 2010/11 pomiędzy 1. a 2. drużyną każdego klubu musi być przynajmniej 2 poziomy różnicy oraz Tennis Borussia Berlin spadła do Oberligi 2010/11 (nie otrzymała licencji na grę w Regionallidze 2010/11, dzięki czemu FC Oberneuland utrzymał się w Regionallidze.
FSV Ludwigshafen-Oggersheim (12 miejsce) nie otrzymał licencji na grę w Regionallidze i w sezonie 2009/10 będzie występował w Verbandslidze Südwest – szósty poziom rozgrywek, dzięki czemu Wormatia Worms utrzymała się w Regionallidze.
SV Waldhof Mannheim, Bonner SC i Rot-Weiss Essen spadły do Oberligi 2010/11 (nie otrzymali licencji na grę w Regionallidze 2010/11, dzięki czemu Borussia Mönchengladbach II, Wormatia Worms i Eintracht Trewir utrzymali się w Regionallidze.
Viktoria Aschaffenburg (13 miejsce) nie otrzymała licencji na grę w Regionallidze i w sezonie 2009/10 będzie występowała w Hessenlidze, dzięki czemu Karlsruher SC II utrzymał się w Regionallidze.
SC Waldgirmes (mistrz Hessenligi) nie otrzymał licencji na grę w Regionallidze Süd i w sezonie 2009/10 będzie nadal występował w Hessenlidze, dzięki czemu FC Bayern Alzenau awansował do Regionalligi.
FC Bayern Alzenau i 1. FC Eintracht Bamberg spadły do Oberligi 2010/11.
SSV Reutlingen 05 spadł do Oberligi 2010/11 (nie otrzymał licencji na grę w Regionallidze 2010/11, dzięki czemu SV Wehen Wiesbaden II utrzymał się w Regionallidze.